Дата:
01.04.2015
  • Поделиться

Ботулотоксин — это яд белковой природы, выделяемый анаэробной почвенной бактерией Clostridium botulinum, один из самых сильных известных токсинов. За 2011 год весь мир израсходовал в медицинских и косметологических целях около 1 грамма чистого токсина [1], а двух килограммов достаточно для того, чтобы убить все население Земли (приблизительная оценка, летальные дозы разных типов токсина различаются). Из почвы споры Clostridium botulinum могут попадать в продукты питания, где при недостатке кислорода прорастают, в результате чего в пище накапливается токсин, который может вызвать отравление. Возможно размножение бактерий в организме человека при инфицировании ран, в также в кишечнике грудных детей, у которых еще не сформировано симбиотическое микробное сообщество. Во всех этих случаях происходит отравление ботулотоксином, и развивается патологическое состояние, которое называется ботулизмом. Существует 7 разных типов ботулотоксина — A, B, C1, D, E, F, G — различающихся особенностями структуры и механизма действия [2]. На человека действуют токсины всех типов, кроме F и G.

Синтез ботулотоксина

Ботулотоксин синтезируется в виде протоксина, который затем разрезается внеклеточной протеазой на две части — тяжелую (100 кДа) и легкую (50 кДа) цепи, соединенные дисульфидным мостиком. С-концевая часть тяжелой цепи необходима для связывания с нейронами, N-концевая — для транслокации легкой цепи через мембрану, в результате чего протеаза оказывается в цитоплазме клетки-мишени. Легкая цепь представляет собой цинковую протеазу термолизин-подобного типа, которая атакует и расщепляет одну из молекул, отвечающих за слияние секреторного пузырька с пресинаптической мембраной — SNAP-25, синтаксин или синаптобревин. В легкой цепи имеется последовательность аминокислот HELIH, типичная для металлопротеаз. [3] Токсин связан с вспомогательными белками — гемагглютинином (НА) и NTNH — которые защищают его от разрушения в пищеварительном тракте жертвы. Комплекс стабилен в кислой среде [4]. Ботулотоксин на 30-40% гомологичен столбнячномутоксину (тетанотоксину), и механизм их действия сходен, однако тетанотоксин не образует комплексов со вспомогательными белками, поэтому не всасывается из ЖКТ и не вызывает пищевых отравлений [5]. Противоположное действие этих токсинов на мышечные сокращения связано с тем, что ботулотоксин поражает мотонейроны, и возникает вялый паралич, а тетанотоксин — ингибиторные интернейроны спинного мозга (клетки Реншоу), что приводит к судорогам. Ботулотоксин не проникает через гематоэнцефалический барьер и, в отличие от столбнячного токсина, не подвержен ретроградному транспорту в нейронах. Гены ботулотоксина и вспомогательных белков собраны в кластер, который может находиться в бактериальной хромосоме, плазмиде или фаговом геноме и подвергается горизонтальному переносу между различными штаммами бактерий посредством конъюгации, трансформации или трансдукции. Показана роль IS-элементов в горизонтальном переносе генов токсинов [6]. В целом, Clostridium botulinum — филогенетически гетерогенная группа бактерий, в геноме которых имеется один из типов кластеров, кодирующих токсин и вспомогательные белки [7].

Вакцина против ботулизма

Ботулотоксин попадает в организм с пищей или водой и проникает в кровь через клетки эпителия тонкого кишечника — энтероциты. Также токсин может всасываться в кровь при вдыхании его в виде аэрозоля. Из крови он попадает в окончания двигательных нейронов. Попавший в клетки яд оказывается недоступным для действия иммуной системы организма, поэтому использование для лечения специфических антител к токсину эффективно только на самых ранних стадиях развития заболевания. В силу высокой активности токсина военные ведомства разных стран рассматривали возможность его использования в качестве биологического оружия, а также как террористическую угрозу. Для защиты солдат от возможного отравления в ходе Второй Мировой войны Министерством обороны США была разработана первая вакцина против ботулизма. С 1957 по 2011 год использовалась в основном пентавалентная вакцина, активная в отношении токсинов типов A, B, C, D и E, затем она была заменена новой гептавалентной вакциной. Иммунизация также проводится среди персонала, работающего с ботулотоксином в медицине, промышленности (припроизводстве препаратов токсина) или исследовательских лабораториях [8].

Попадание ботулотоксина в энтероциты

Ботулотоксин проникает в энтероциты путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, для которого необходим С-концевой участок тяжелой цепи, попадает в кровоток и затем эндоцитируется нейронами [9]. Связывание токсина с мембраной клетки описывается моделью двух рецепторов: сначала яд узнается ганглиозидами с двумя и более остатками сиаловой кислоты, например, GT1b. Аффинность этого взаимодействия невысока, но в результате он более эффективно связывается со вторичными рецепторами — мембранными белками Syt-II и SV2C. В результате эндоцитоза ботулотоксин оказывается в эндосомах. Затем происходит транслокация легких цепей через эндосомальную мембрану. При этом тяжелые цепи формируют в мембране канал, через который проходит легкая цепь.Транслокация ингибируется агентами, препятстсвующими снижение рН эндосом (например, хлорохином).

Воздействие на нервную систему

Ботулотоксин блокирует передачу импульса от нервного окончания к мышце, действуя на процесс выброса нервным окончанием нейромедиатора ацетилхолина из везикул. Везикулярный транспорт необходим для жизнедеятельности всех клеток человека. Существует механизм адресной доставки везикул к месту назначения в клетке — к поверхности клетки или органеллам вакуолярной системы (системы внутренних мембран), к которой относятся аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум, лизосомы. Направленный транспорт возможен благодаря системе взаимного узнавания везикулы и пункта назначения за счет связывания белков SNARE, встроенных в их мембраны. Механизм направленного транспорта внутриклеточных везикул играет большую роль в функционировании нервных клеток, поскольку их многочисленные отростки формируют контакты с другими клетками и функционально различны. В частности, такая система необходима для выброса нейромедиатора и передачи нервного импульса от нейрона к мышце. Нейромедиатор транспортируется в нервное окончание, где сохраняется вблизи пресинаптической мембраны и высвобождается при возбуждении нейрона за счет слияния с транспортной везикулы и пресинаптической мембраны нейрона.

Ботулотоксин нарушает нормальный процесс выброса нейромедиатора ацетилхолина двигательными нейронами, расщепляя одну из молекул, необходимых для связывания везикулы с пресинаптической мембраной. В результате нервно-мышечная передача блокируется и развиваются мышечные параличи. Если они затрагивают дыхательные мышцы, то это может привести к летальному исходу. Помочь таким больным можно путем искусственной вентиляции легких. Обычно она требуется в течение 4-6 недель. Действие токсина длится от нескольких недель до нескольких месяцев, после чего передача импульсов нормализуется. Восстановление нейронов после отравления ботулотоксином происходит в две стадии: на первом этапе наблюдается рост новых нервных окончаний, обеспечивающих нормальную иннервацию мышцы, затем восстанавливается функция исходного нервного окончания, после чего вновьобразовавшиеся «дочерние» окончания деградируют [10].

Воздействие ботулотоксинов на белки SNARE

В мембране везикулы находится R-SNARE (Soluble NSF Attachment Protein REceptor), в мембране органеллы-мишени — Q-SNARE. Существуют различные типы SNARE, благодаря чему везикула, маркированная определенным типом R-SNARE, направляется к определенной органелле, несущей «комплементарный» Q-SNARE.SNAP-25 (один из R-SNARE) — это молекула, которая необходима для экзоцитоза пузырьков с нейротрансмиттером ацетилхолином в различных нейронах, в частности, в мотонейронах. Выброс ацетилхолина из нервного окончания заставляет иннервируемую мышцу сократиться. Легкая цепь ботулотоксина типа А представляет собой протеазу, которая способна специфически связывать и разрезать молекулу SNAP-25. Ботулотоксины типов B, D, F, G и легкая цепь тетанотоксина расщепляют синаптобревин, который также является R-SNARE. Ботулотоксин типа С также атакует молекулу синтаксина-1, расположенную в пресинаптической мембране.

Использование в медицине

Известно, что в низких концентрациях многие яды могут быть использованы в качестве лекарств. Ботулотоксин — не исключение. Благодаря своей способности блокировать нервно-мышечную передачу он используется в очень низких концентрациях для снятия мышечных спазмов, сопровождающих многие заболевания. История использования ботулотоксина в медицине начинается в конце 60-х годов — американские и канадские офтальмологии стали применять его для лечения косоглазия и блефароспазма — непроизвольного сокращения круговой мышцы глаза, приводящего к смыканию век. Препарат хорошо себя зарекомендовал, и FDA (USA Food and Drug Administration) разрешила применять его для лечения этих заболеваний у взрослых пациентов. Затем список заболеваний, поддающихся лечению ботулотоксином, был существенно расширен. Он используется для лечения дистонии шейки матки, церебрального паралича, а также гипергидроза, или повышенной потливости, так как блокирует иннервацию потовых желез. В косметологии ботулотоксин (тип А, на фото), известный под марками «Ботокс» и «Диспорт», используется для коррекции морщин, так как вызывает временное обратимое расслабление мимических мышц. Впервые его использовал с целью коррекции асимметрии лица пластический хирург из Калифорнии, доктор Ричард Кларк в 1989 году [11]. В 2002 году FDA разрешило использование токсина в качестве средства от глабеллярных морщин — тех, что появляются между бровями, когда мы хмуримся [12].

  • Руководство проекта, 3D-визуализация:
    Иван Константинов
  • Научная консультация, тексты:
    Алина Корбут
Molecular modelling through computer graphics permits plenty of latitude for exercising artistic talent to inform, explain and instruct. Visual Science shows the way with its high quality, accurate, informative graphics that explain even the most complex processes of life
Lewis Sadler MA, Msc. Chief Science Officer at Visible Productions Inc., Research Assistant Prof. University of Illinois at Chicago, (US)